Dal rosa al blu al vicino IR, le macchie di proteine sono disponibili in un’ampia varietà di colori. Come biologi proteici, queste macchie svolgono un ruolo cruciale nel nostro lavoro di laboratorio quotidiano per l’analisi proteica di routine e la normalizzazione della western blot. In effetti, diversi studi hanno scoperto che la normalizzazione per proteina totale è superiore alla normalizzazione con proteine per la pulizia domestica come tubulina o actina 1-3. Tuttavia, ogni colorazione proteica è unica, con vantaggi e svantaggi intrinseci che dovrebbero essere considerati nell’interpretazione dei risultati. In onore della nostra prestaina proteica appena rilasciata, VersaBlot ™, abbiamo deciso di fornire ai nostri lettori una guida per alcune delle più comuni macchie proteiche che include uno sguardo ravvicinato alle loro origini, vantaggi e limiti.
Ecco una tabella utile che riassume le macchie proteiche discusse in questo articolo e le macchie offerte da Biotium.
La “classica” Blue Coomassie
Una guida per la colorazione delle proteine dovrebbe giustamente iniziare con la colorazione proteica più utilizzata, Coomassie Brilliant Blue (CBB). Il CBB fu usato per la prima volta come tintura di lana acida nel 19 ° secolo da un produttore di tinture britannico di nome Levinstein Ltd. Dal 1964, un biochimico australiano di nome Fazekas De St. Growth e colleghi scoprirono la sua applicazione per la colorazione delle proteine dopo l’elettroforesi su gel4. Da allora, sono state sviluppate diverse versioni di CBB, inclusa la formulazione G-250 “colloidale” ampiamente accettata che è più sensibile e ha meno background rispetto alla vecchia forma R-250. Il CBB è molto popolare nei laboratori perché la colorazione è economica e facile da visualizzare. Inoltre, il protocollo di colorazione richiede un solo reagente preparato e si lega alle proteine in modo non covalente attraverso interazioni con residui basici e aromatici. Nonostante questi vantaggi, il CBB manca di sensibilità rispetto ai metodi di colorazione alternativi (es. Colorazione d’argento, fluorescenza) e ha un intervallo lineare ristretto. Inoltre, le membrane trattate con CBB devono essere completamente eliminate o il colorante può interferire con l’analisi a valle.
Vantaggi: economico e facile da visualizzare.
Svantaggi: mancanza di sensibilità, piccolo intervallo lineare, il colorante può interferire con il legame degli anticorpi a valle e l’analisi della spettrometria di massa.
Utilizzare per: Gel o membrana quando è necessaria una colorazione proteica totale economica. Se prevedi di usare il western blot, macchia la membrana dopo il trasferimento e prima del blocco.
Alternative: dai un’occhiata a One-Step Blue® come alternativa più conveniente e versatile alla colorazione con CBB.
Ponceau S, Pink Proteins on the Go
Ponceau, francese per “color papavero”, descrive una famiglia di coloranti Azo rossi usati come coloranti alimentari e macchie di istologia. Ciò che conosciamo come Ponceau nei nostri laboratori è la formulazione Ponceau S, una colorazione proteica totale reversibile per le membrane Western Blot. Come il CBB, Ponceau si lega anche alle proteine in modo non covalente attraverso interazioni ioniche e idrofobiche. Tuttavia, a differenza del protocollo di colorazione più lungo di CBB (almeno 45 minuti più destaining), la colorazione di Ponceau può essere eseguita in pochi minuti e può essere rapidamente eliminata con acqua. Queste comodità consentono a Ponceau di essere un metodo rapido per visualizzare le proteine totali sulle macchie occidentali. Tuttavia, quando Ponceau guadagna in comodità perde in sensibilità. Ponceau è una delle tecniche di colorazione meno sensibili con un rilevamento minimo di 200 ng5. Inoltre, la colorazione è considerevolmente più debole del CBB e può sbiadire gli straordinari, rendendo la normalizzazione meno riproducibile tra gli esperimenti.
Vantaggi: economico, rapido e reversibile.
Svantaggi: scarsa sensibilità e riproducibilità. Non raccomandato per la normalizzazione.
Utilizzare per: colorazione a membrana solo come metodo rapido per verificare l’efficienza del trasferimento di proteine per la western blotting.
La sensibile macchia d’argento
La colorazione dell’argento è considerata lo standard di riferimento per i metodi di rilevazione delle proteine sensibili. La tecnica è stata sviluppata per la prima volta per SDS-PAGE da Switzer et. nel 1979, che ha consentito il rilevamento di sub-nanogrammi e una sensibilità 50 volte maggiore rispetto alla colorazione con CBB6. È interessante notare che il meccanismo alla base di questa sensibilità si basa su una chimica simile allo sviluppo del film in fotografia. I gel proteici sono impregnati di ioni argento (Ag +) che si legano a vari gruppi funzionali di aminoacidi. L’argento viene quindi ridotto a metallo argentato, un processo che è auto-catalitico, consentendo il rilevamento ultrasensibile delle bande proteiche. Sfortunatamente, questa sensibilità non è priva di gravi inconvenienti. Il processo di colorazione può essere molto tecnico e ha una gamma lineare stretta, che porta a una scarsa riproducibilità. Inoltre, la colorazione è irreversibile e solo per uso di gel e quindi non adatta per analisi a valle come spettrometria di massa o western blotting.
Vantaggi: economico con eccellente sensibilità.
Svantaggi: dispendioso in termini di tempo, scarsa riproducibilità e linearità, non compatibile con l’analisi a valle.
Utilizzare per: Gel colorante solo quando è necessaria la sensibilità al di sotto dei nanogrammi per la proteina totale.
SYPRO® Ruby, una nuova era
Nonostante le colorazioni colorimetriche popolari ed economiche, gli svantaggi con sensibilità, linearità e compatibilità con l’analisi a valle hanno portato allo sviluppo di metodi di rilevazione delle proteine più avanzati. Inserisci SYPRO® Ruby, un colorante fluorescente a base di rutenio che è stato sviluppato da Molecular Probes nel 20007. La colorazione SYPRO® Ruby ha permesso la sensibilità alla macchia d’argento ma con un intervallo lineare maggiore e compatibilità con l’analisi a valle. Inoltre, la facilità d’uso e l’elevata riproducibilità di SYPRO® Ruby come colorante proteico totale hanno fornito un metodo superiore per la normalizzazione della western blot rispetto alle proteine domestiche tradizionali1. Oltre un decennio più tardi, sono state sviluppate diverse altre macchie di proteine a base di fluorescenza tra cui LI-COR REVERT ™, Bio-Rad Stain-Free ™ e Amersham ™ Quickstain. Uno svantaggio per le macchie fluorescenti è che sono generalmente più costosi dei metodi colorimetrici e richiedono una termocamera. Tuttavia, man mano che la comunità di ricerca si sposta gradualmente verso tecnologie basate sulla fluorescenza, i dispositivi di imaging a fluorescenza stanno diventando molto più comuni e convenienti.
Vantaggi: comodo, sensibile, ampio intervallo lineare e compatibile con analisi a valle multiple.
Svantaggi: più costoso dei metodi colorimetrici e richiede una termocamera.
Utilizzare per: Esistono formulazioni SYPRO ® Ruby specifiche per il rilevamento di proteine di gel o membrana. Può essere utilizzato per diverse applicazioni tra cui la normalizzazione della western blot e la spettrometria di massa.
Alternative: dai un’occhiata a One-Step Lumitein ™ e One-Step Lumitein ™ UV come alternativa economica e conveniente a SYPRO ® Ruby.
VersaBlot ™, conveniente, altamente lineare e reversibile
Il biotio ha favorito l’avanzamento del rilevamento di proteine fluorescenti con VersaBlot ™, una sostanza altamente lineare, sensibile e reversibile. A differenza delle colorazioni proteiche colorimetriche o fluorescenti in cui viene eseguita la colorazione dopo l’esecuzione del gel, VersaBlot ™ viene aggiunto al campione prima dell’elettroforesi e può essere utilizzato per la normalizzazione della macchia occidentale a valle. Il kit di normalizzazione delle proteine totali VersaBlot ™ viene fornito con due coloranti CF® near-IR scelti per l’emissione in Odyssey® 700 o 800 canali.
Vantaggi: comodo, sensibile con un’ampia gamma lineare. Il segnale può essere disattivato per il rilevamento near-IR multicolore a valle.
Svantaggi: più costoso dei metodi colorimetrici, richiede un riproduttore d’immagini a fluorescenza quasi IR.
Utilizzare per: un metodo conveniente per la normalizzazione della western blot e il rilevamento della proteina near-IR multicolore a valle.