La tua guida per le macchie di proteine

Dal rosa al blu al vicino IR, le macchie di proteine ​​sono disponibili in un’ampia varietà di colori. Come biologi proteici, queste macchie svolgono un ruolo cruciale nel nostro lavoro di laboratorio quotidiano per l’analisi proteica di routine e la normalizzazione della western blot. In effetti, diversi studi hanno scoperto che la normalizzazione per proteina totale è superiore alla normalizzazione con proteine ​​per la pulizia domestica come tubulina o actina 1-3. Tuttavia, ogni colorazione proteica è unica, con vantaggi e svantaggi intrinseci che dovrebbero essere considerati nell’interpretazione dei risultati. In onore della nostra prestaina proteica appena rilasciata, VersaBlot ™, abbiamo deciso di fornire ai nostri lettori una guida per alcune delle più comuni macchie proteiche che include uno sguardo ravvicinato alle loro origini, vantaggi e limiti.

Ecco una tabella utile che riassume le macchie proteiche discusse in questo articolo e le macchie offerte da Biotium.

La “classica” Blue Coomassie

Una guida per la colorazione delle proteine ​​dovrebbe giustamente iniziare con la colorazione proteica più utilizzata, Coomassie Brilliant Blue (CBB). Il CBB fu usato per la prima volta come tintura di lana acida nel 19 ° secolo da un produttore di tinture britannico di nome Levinstein Ltd. Dal 1964, un biochimico australiano di nome Fazekas De St. Growth e colleghi scoprirono la sua applicazione per la colorazione delle proteine ​​dopo l’elettroforesi su gel4. Da allora, sono state sviluppate diverse versioni di CBB, inclusa la formulazione G-250 “colloidale” ampiamente accettata che è più sensibile e ha meno background rispetto alla vecchia forma R-250. Il CBB è molto popolare nei laboratori perché la colorazione è economica e facile da visualizzare. Inoltre, il protocollo di colorazione richiede un solo reagente preparato e si lega alle proteine ​​in modo non covalente attraverso interazioni con residui basici e aromatici. Nonostante questi vantaggi, il CBB manca di sensibilità rispetto ai metodi di colorazione alternativi (es. Colorazione d’argento, fluorescenza) e ha un intervallo lineare ristretto. Inoltre, le membrane trattate con CBB devono essere completamente eliminate o il colorante può interferire con l’analisi a valle.

Vantaggi: economico e facile da visualizzare.

Svantaggi: mancanza di sensibilità, piccolo intervallo lineare, il colorante può interferire con il legame degli anticorpi a valle e l’analisi della spettrometria di massa.

Utilizzare per: Gel o membrana quando è necessaria una colorazione proteica totale economica. Se prevedi di usare il western blot, macchia la membrana dopo il trasferimento e prima del blocco.

Alternative: dai un’occhiata a One-Step Blue® come alternativa più conveniente e versatile alla colorazione con CBB.

Ponceau S, Pink Proteins on the Go

Ponceau, francese per “color papavero”, descrive una famiglia di coloranti Azo rossi usati come coloranti alimentari e macchie di istologia. Ciò che conosciamo come Ponceau nei nostri laboratori è la formulazione Ponceau S, una colorazione proteica totale reversibile per le membrane Western Blot. Come il CBB, Ponceau si lega anche alle proteine ​​in modo non covalente attraverso interazioni ioniche e idrofobiche. Tuttavia, a differenza del protocollo di colorazione più lungo di CBB (almeno 45 minuti più destaining), la colorazione di Ponceau può essere eseguita in pochi minuti e può essere rapidamente eliminata con acqua. Queste comodità consentono a Ponceau di essere un metodo rapido per visualizzare le proteine ​​totali sulle macchie occidentali. Tuttavia, quando Ponceau guadagna in comodità perde in sensibilità. Ponceau è una delle tecniche di colorazione meno sensibili con un rilevamento minimo di 200 ng5. Inoltre, la colorazione è considerevolmente più debole del CBB e può sbiadire gli straordinari, rendendo la normalizzazione meno riproducibile tra gli esperimenti.

Vantaggi: economico, rapido e reversibile.

Svantaggi: scarsa sensibilità e riproducibilità. Non raccomandato per la normalizzazione.

Utilizzare per: colorazione a membrana solo come metodo rapido per verificare l’efficienza del trasferimento di proteine ​​per la western blotting.

La sensibile macchia d’argento

La colorazione dell’argento è considerata lo standard di riferimento per i metodi di rilevazione delle proteine ​​sensibili. La tecnica è stata sviluppata per la prima volta per SDS-PAGE da Switzer et. nel 1979, che ha consentito il rilevamento di sub-nanogrammi e una sensibilità 50 volte maggiore rispetto alla colorazione con CBB6. È interessante notare che il meccanismo alla base di questa sensibilità si basa su una chimica simile allo sviluppo del film in fotografia. I gel proteici sono impregnati di ioni argento (Ag +) che si legano a vari gruppi funzionali di aminoacidi. L’argento viene quindi ridotto a metallo argentato, un processo che è auto-catalitico, consentendo il rilevamento ultrasensibile delle bande proteiche. Sfortunatamente, questa sensibilità non è priva di gravi inconvenienti. Il processo di colorazione può essere molto tecnico e ha una gamma lineare stretta, che porta a una scarsa riproducibilità. Inoltre, la colorazione è irreversibile e solo per uso di gel e quindi non adatta per analisi a valle come spettrometria di massa o western blotting.

Vantaggi: economico con eccellente sensibilità.

Svantaggi: dispendioso in termini di tempo, scarsa riproducibilità e linearità, non compatibile con l’analisi a valle.

Utilizzare per: Gel colorante solo quando è necessaria la sensibilità al di sotto dei nanogrammi per la proteina totale.

SYPRO® Ruby, una nuova era

Nonostante le colorazioni colorimetriche popolari ed economiche, gli svantaggi con sensibilità, linearità e compatibilità con l’analisi a valle hanno portato allo sviluppo di metodi di rilevazione delle proteine ​​più avanzati. Inserisci SYPRO® Ruby, un colorante fluorescente a base di rutenio che è stato sviluppato da Molecular Probes nel 20007. La colorazione SYPRO® Ruby ha permesso la sensibilità alla macchia d’argento ma con un intervallo lineare maggiore e compatibilità con l’analisi a valle. Inoltre, la facilità d’uso e l’elevata riproducibilità di SYPRO® Ruby come colorante proteico totale hanno fornito un metodo superiore per la normalizzazione della western blot rispetto alle proteine ​​domestiche tradizionali1. Oltre un decennio più tardi, sono state sviluppate diverse altre macchie di proteine ​​a base di fluorescenza tra cui LI-COR REVERT ™, Bio-Rad Stain-Free ™ e Amersham ™ Quickstain. Uno svantaggio per le macchie fluorescenti è che sono generalmente più costosi dei metodi colorimetrici e richiedono una termocamera. Tuttavia, man mano che la comunità di ricerca si sposta gradualmente verso tecnologie basate sulla fluorescenza, i dispositivi di imaging a fluorescenza stanno diventando molto più comuni e convenienti.

Vantaggi: comodo, sensibile, ampio intervallo lineare e compatibile con analisi a valle multiple.

Svantaggi: più costoso dei metodi colorimetrici e richiede una termocamera.

Utilizzare per: Esistono formulazioni SYPRO ® Ruby specifiche per il rilevamento di proteine ​​di gel o membrana. Può essere utilizzato per diverse applicazioni tra cui la normalizzazione della western blot e la spettrometria di massa.

Alternative: dai un’occhiata a One-Step Lumitein ™ e One-Step Lumitein ™ UV come alternativa economica e conveniente a SYPRO ® Ruby.

VersaBlot ™, conveniente, altamente lineare e reversibile

Il biotio ha favorito l’avanzamento del rilevamento di proteine ​​fluorescenti con VersaBlot ™, una sostanza altamente lineare, sensibile e reversibile. A differenza delle colorazioni proteiche colorimetriche o fluorescenti in cui viene eseguita la colorazione dopo l’esecuzione del gel, VersaBlot ™ viene aggiunto al campione prima dell’elettroforesi e può essere utilizzato per la normalizzazione della macchia occidentale a valle. Il kit di normalizzazione delle proteine ​​totali VersaBlot ™ viene fornito con due coloranti CF® near-IR scelti per l’emissione in Odyssey® 700 o 800 canali.

Vantaggi: comodo, sensibile con un’ampia gamma lineare. Il segnale può essere disattivato per il rilevamento near-IR multicolore a valle.

Svantaggi: più costoso dei metodi colorimetrici, richiede un riproduttore d’immagini a fluorescenza quasi IR.

Utilizzare per: un metodo conveniente per la normalizzazione della western blot e il rilevamento della proteina near-IR multicolore a valle.